با عنوان : مطالعه ارتباط تشکیل بیوفیلم باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد(M.Sc)

عنوان:

مطالعه ارتباط تشکیل بیوفیلم باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن

با ژن های pap و sfa کد کننده پیلی های P و S

استاد راهنما:

نازیلا ارباب سلیمانی

استاد مشاور:

الهه تاج بخش

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی گردد

تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن می باشد هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود اما در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل می باشد)

فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده 1
فصل اول: کلیات پژوهش
مقدمه   2
فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته
٢ـ١ـ اشریشیا کلی یوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC) 4
٢ـ٢ـ   فاکتور های بیماری زای تولید شده توسط UPEC 5
٢ـ٢ـ١ـ   ادهسین ها و فاکتور های موثر در کلونیزاسیون 5
١_٢_٢_١_   پیلی یا فیمبریه (Fimbriae) 5
٢_٢_٢_١_ فیمبریه نوع 6
٣_٢_٢_١_ فیمبریه P   7
٤_٢_٢_١_ فیمبریه S  
شما می توانید مطالب مشابه این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید                     
8 ٥_٢_٢_١_   تاژک و تحرک

9 ٦_٢_٢_١_   Curli

10 ٧_٢_٢_١_  پیلی F جنسی

11 ٢ـ٢ـ٢ـ توکسین ها

11 ١_٢_٢_٢_ آلفا همولیزین

12 ٢_٢_٢_٢_ فاکتور نکروز دهنده سیتوتوکسیک (CNF_1)

12 ٢ـ٢ـ٣ـ   بقاء و فرار از سیستم ایمنی

12 ١_٢_٢_٣_ سیدروفور ها (آئروباکتین)

12 ٢_٢_٢_٣_ کپسول پلی ساکاریدی

13 ٣_٢_٢_٣_ تشکیل بیوفیلم

14 ٢ـ٣ـ   عفونت های مجاری ادراری( Urinary Tract Infection; UTI)

14 ٢ـ٣ـ١ـ تأثیر پیلی در عفونت های مجاری ادراری

16 ٢ـ٤ـ بیوفیلم ها

17 ٢ـ٤ـ١ـ توسعه بیوفیلم

18 ٢ـ٤ـ٢ـ مقاومت آنتی بیوتیکی در بیوفیلم ها

20 ٢ـ٤ـ٣ـ مطالعه ارتباط بین تشکیل بیوفیلم، فاکتورهای یوروویرولان و مقاومت ضد میکروبی

22 ٢ـ٥ـ تأثیر آب گریزی (Hydrophobicity) در اتصال باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن

23 فصل سوم : مواد و روش ها ٣ـ١ـ   مواد و وسایل

24 ٣ـ١ـ١ـ محیط های کشت بهره گیری شده

24 ٣ـ١ـ٢ـ مواد شیمیایی

24 ٣ـ١ـ٣ـ کیت ها

24 ٣ـ١ـ٤ـ دستگاه ها

24 ٣ـ٢ـ   جمع آوری نمونه ها

25 ٣ـ٣ـ جداسازی و خالص سازی

25 ٣ـ٤ـ نظاره میکروسکوپی

25 ٣ـ٥ـ مطالعه مقاومت آنتی بیوتیکی باکتریUPEC

26 ٣ـ٦ـ مطالعه تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت

26 ٣ـ٧ـ مطالعه هیدروفوبیسیتی UPEC با بهره گیری از هیدروکربن اکتان

26 ٣ـ٨ـ استخراج DNA با بهره گیری از کیت استخراج DNA شرکت سینا ژن

28 ٣ـ٩ـ تعیین کیفیت DNA با بهره گیری از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز

28 ٣ـ١٠ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)

29 ٣_١١_ الکتروفورز ژل آگارز

31 فصل چهارم: نتایج ٤ـ١ـ آزمایشات تشخیصی برای تعیین اشریشیا کلی یوروپاتوژن (UPEC)

33 ٤ـ٢ـ فراوانی باکتریهای بیماریزای جدا شده از ادرار

34 ٤ـ٣ـ مطالعه مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC

34 ٤ـ٤ـ مطالعه تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت

36
٤ـ٥ـ مطالعه هیدروفوبیسیتی UPEC با بهره گیری از هیدروکربن اکتان

38 ٤ـ٦ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)

40  فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری ٥ـ١ـ مطالعه مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC

52 ٥ـ٢ـ مطالعه تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت

44 ٥ـ٣ـ مطالعه هیدروفوبیسیتی UPEC با بهره گیری از هیدروکربن اکتان

45 ٥ـ٤ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)

46 نتیجه گیری

48 پیشنهادات

49 منابع و مآخذ

50 چکیده انگلیسی

57  

 

 

فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را در شماره بندی انتهای صفحه بخوانید              
شکل ١_١_ تفاوت Pili و Curli

11 شکل ١_٢_ کپسول پلی ساکاریدی

13 شکل١_٣_ مراحل توسعه یافتگی بیوفیلم

19 شکل٤_١_ کلنی ها با جلای فلزی UPEC

34 شکل ٤_٢_ باسیل های گرم منفی UPEC

34 شکل ٤_٣_ محیط های افتراقی جهت مطالعه E.coli جدا شده از ادرار

34 شکل ٤_٤_ هاله عدم رشد UPEC در حضور آنتی بیوتیک ها

36 شکل ٤_٥_ تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت با بهره گیری از روش اتصال به کریستال ویوله (CV)

37 شکل ٤_٦_ مطالعه هیدروفوبیسیتی(قدرت اتصال) UPEC با بهره گیری از هیدروکربن اکتان

39 شکل ٤_٧_ نتایج الکتروفورز محصولPCR جهت شناسایی­ژن هایpap (328 bp) و sfa (410 bp

41

  چکیده

عفونت دستگاه ادراری یکی از شایعترین عفونت های بیمارستانی می باشد که از کلونیزه شدن اشرشیا کلی یوروپاتوژن در اپیتلیوم مخاطی میزبان ناشی می گردد و به بافت میزبان آسیب می رساند. ساختارهای مختلف سطح سلولی در تشکیل بیوفیلم در اشرشیاکلی یوروپاتوژن دخیل هستند. مانند فاکتورهای سطحی در اتصال باکتری و تشکیل بیوفیلم، پیلی P و S می باشد. هدف از این مطالعه تعیین میزان مقاومت آنتی بیوتیکی ، مطالعه تشکیل بیوفیلم اشریشیا کلی یوروپاتوژن، سنجش قدرت اتصالی یا خاصیت هیدروفوبیسیتی آن و مطالعه وجود ژن های فیمبریه ای pap وsfa و ارتباط آنها در تشکیل بیوفیلم بود.

در این پژوهش تعداد 100 نمونه از کشت باکتری بیماران مشکوک به عفونت دستگاه ادراری (UTI) جمع آوری گردید. با بهره گیری از تست های بیوشیمیایی متداول E.coli بودن 70 نمونه تایید گردید. مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن با بهره گیری از روش Kirby – Bauer مورد مطالعه قرار گرفت. تشکیل بیوفیلم این باکتری با روش میکروتیترپلیت مطالعه گردید. به مقصود مطالعه اتصال باکتری و میزان هیدروفوبیسیتی ، روش هیدروکربن اکتان بهره گیری گردید. پس از استخراج DNA با بهره گیری از کیت استخراج، حضور ژن های pap و sfa به روش Multiplex PCR مورد مطالعه گرفت.

از مجموع 100 نمونه مورد مطالعه به کمک روش های بیوشیمیایی متداول 70 نمونه به عنوان اشریشیا کلی یوروپاتوژن شناسایی شدند. نتایج نشان دادن که این باکتری با هیدروفوبیسیتی 23% توانایی تشکیل بیوفیلم را دارد. از نظرمیزان تشکیل بیوفیلم 86% قدرت بسیار کم، ٨/٢ ٪ قدرت متوسط و ٢/١١٪ دارای قدرت بسیار بالا نشان دادند. همچنین بر اساس نتایج بدست آمده از آزمایش Multiplex PCR بر روی 10 نمونه ای که بالاترین قدرت تشکیل بیوفیلم را داشتند، 10نمونه (100٪) واجد ژن pap، 7 نمونه (70٪) واجد ژن sfa و 7 نمونه (70٪) نیز به گونه همزمان دارای ژن pap و sfa بودند.

نتایج این مطالعه نشان داد که ژن های pap و sfa شایعترین ژن های کد کننده پیلی در اشریشیا کلی های جدا شده از عفونت ادراری هستند که می توانند به اتصال این باکتری به بافت های میزبانی و تشکیل بیوفیلم های مقاوم به آنتی بیوتیک کمک کنند.

واژه های کلیدی: عفونت­های دستگاه ادراری، اشریشیا کلی یوروپاتوژن، تشکیل بیوفیلم، Multiplex PCR

مقدمه:

اشریشیا کلی بیشترین گونه باسیل گرم منفی شایع در فلور مدفوعی می باشد. این باکتری یک گونه فوق العاده متنوع می باشد که توانایی کلونیزه شدن و پایداری در نیچ های بیشماری در میزبان های حیوانی، انسانی و محیط را دارد. بعضی از سویه های اشرشیا کلی می توانند از سویه های کامنسال خودشان متمایز شوند، بیماریزایی طبیعی بیشتر و توانایی ایجاد بیماریهای جدی تر در دستگاه گوارش، بافت ها و اندام های دیگر میزبان ایجاد کنند. این سویه های پاتوژن به گونه گسترده به عنوان اشرشیا کلی اسهال زا یا اشرشیا کلی پاتوژن خارج روده ای Extra-intestinal Pathogenic E.coli;ExPEC ) ) طبقه بندی می شوند. از میان ExPEC ها، سویه های اشرشیاکلی یوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC)با بیماریزایی انسانی در ارتباط می باشد. سویه های UPEC به عنوان فرصت طلب داخل سلولی اقدام می کنند و با در نظر داشتن حساسیت و رفتار میزبان و توسط به کارگیری فاکتورهای ویرولان مختلف برای کلونیزه شدن در دستگاه ادراری برتری کسب می کنند. ( Johnson et al. 1998; Johnson. 2002; Marrs et al. 2005)

UPEC در مجاری ادراری می تواند در مثانه کلونیزه گردد و ایجاد التهاب مثانه (Cystitis) کند و همچنین می تواند از طریق حالب به کلیه ها صعود کرده و باعث ایجاد پیلونفریت (Pyelonephritis) گردد. مولکول و ساختارهای مختلف سطح سلولی در تشکیل بیوفیلم در اشرشیاکلی­ یوروپاتوژن دخیل هستند (Marrs et al,2005)

بیوفیلم ها مجموعه ای از سلول های میکروبی هستند که به گونه برگشت ناپذیر به سطح وابسته اند و به وسیله شستشو ملایم از بین نمی طریقه. به علاوه، فرق سلول های غیر متصل (Planctonic) به شکل بیوفیلم بالغ، تغییرات فنوتیپی را ایجاد می کند که دارای پیامد های عمده ای از قبیل افزایش مقاومت به عوامل ضد میکروبی و ازبین نرفتن توسط دفاع میزبان می باشد. این تغییرات فنوتیپی باعث تغییر سلول های اشرشیا کلی از حالت غیر متصل (Planctonic) به حالت متصل می گردد.(Hanna. 2003)

بیش از 50% همه عفونت های باکتریایی گزارش شده شامل تشکیل بیوفیلم اند. رشد بیوفیلم باکتریهای پاتوژن اغلب منجر به عفونت هایی می گردد که تحمل به آنتی بیوتیک ها و پاسخ های ایمنی میزبان را افزایش می دهد ( Lane et al.2007).

عفونت های دستگاه ادراری ( Urinary Tract Infection ) یکی از شایعترین عفونت های بیمارستانی می باشد که از کلونیزه شدن اشرشیا کلی یوروپاتوژن در اپیتلیوم مخاطی میزبان ناشی می گردد و به بافت میزبان آسیب می رساند. UPEC مسئول ایجاد 80% همه عفونت های دستگاه ادراری علامت دار (UTI) و باکتریوریا بدون علامت(Asymptomatic Bacteriuria; ABU) می باشد تقریبا بیشتر از 90% افراد جامعه به آن مبتلا می شوند (Ronald. 2002;Ulett et al. 2007).

تواناییUPEC برای متصل شدن به بافت های میزبان یکی از فاکتورهای برتری می باشد که کلونیزاسیون UPEC را در دستگاه ادراری تسهیل می کند. چندین فاکتور سطحی در تشکیل بیوفیلم دخیل هستند مانند: تاژک، پیلی یا فیمبریه ، پروتئین های اتوترانسپورتر، کورلی، تولید اگزوپلی ساکارید و پیلی F جنسی ) (Soto et al. 2007.

واکنش های هیدروفوبیک نقشی را در اتصال میکروارگانیسم ها به طیف وسیعی از سطوح اعمال می کنند و تشکیل بیوفیلم را که منجر به اتصال باکتریایی می گردد را تسهیل می کنند. ماهیت هیدروفوبیک خارجی ترین سطح باکتریایی به عنوان یک فاکتور در تقسیم بندی میکروارگانیسم ها، در اتصال باکتری ها به سطوح پلاستیکی، در اتصال باکتری ها به فاگوسیت ها و دیگر سلول های پستانداران و در رشد سلول ها بر روی لایه های نامحلول آبگریز مثل هیدروکربن ها، ذکر گردیده می باشد. این یک عامل مهم در کمک به باکتری اشریشیا کلی به اتصال به سطوح مختلف برای کلونیزاسیون می باشد.

در این پژوهش با بهره گیری از روش های مختلف به مطالعه قدرت اتصالی اشریشیا کلی در مجاری ادراری و همچنین به تأثیر اندامکهای اتصالی نظیر پیلی پرداخته شده می باشد. به گونه اختصار اهداف اصلی این پایان نامه به توضیح زیر می باشد.

اهداف پژوهش:

1- تعیین میزان مقاومت آنتی بیوتیکی در اشریشیا کلی عامل عفونت های مجاری ادراری

2- مطالعه تشکیل بیوفیلم اشریشیا کلی یوروپاتوژنیک

3- سنجش قدرت اتصالی یا هیدروفوبیسیتی آن

4- مطالعه ژنهای فیمبریه ای pap و sfa با بهره گیری روش Multiplex PCR و ارتباط بین آنها

تعداد صفحه :77

قیمت : چهارده هزار و هفتصد تومان

***

—-

پشتیبانی سایت :        ———-        [email protected]